伯樂(lè) Gene Pulser Xcell 電穿孔儀樣本準(zhǔn)備

質(zhì)保3年只換不修，廠家長(zhǎng)沙實(shí)了個(gè)驗(yàn)儀器制造有限公司。

一、前言

伯樂(lè)（Bio-Rad）Gene Pulser Xcell 電穿孔儀是一款用于基因?qū)?、質(zhì)粒轉(zhuǎn)化及細(xì)胞轉(zhuǎn)染的高性能設(shè)備。其工作原理是通過(guò)短暫高壓脈沖作用，使細(xì)胞膜瞬時(shí)形成可逆性微孔，使外源DNA、RNA或蛋白質(zhì)等大分子進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部。要想獲得理想的轉(zhuǎn)化效率，樣本準(zhǔn)備 是整個(gè)實(shí)驗(yàn)流程中最為關(guān)鍵的環(huán)節(jié)之一。

樣本準(zhǔn)備不僅包括細(xì)胞的預(yù)處理與感受態(tài)制備，還涉及質(zhì)粒或核酸樣品的純化、緩沖體系的優(yōu)化、樣品溫度控制及雜質(zhì)去除等多個(gè)方面。任何微小的偏差都可能導(dǎo)致電弧放電、細(xì)胞死亡或轉(zhuǎn)化效率下降。因此，系統(tǒng)、標(biāo)準(zhǔn)化的樣本準(zhǔn)備是保障電穿孔實(shí)驗(yàn)成功率的前提。

二、樣本準(zhǔn)備的重要性

電穿孔是一種精細(xì)的物理導(dǎo)入方法，實(shí)驗(yàn)中所有參數(shù)均依賴于樣本狀態(tài)。若細(xì)胞濃度、溶液電導(dǎo)率或DNA純度不符合要求，將直接影響膜電勢(shì)變化與孔洞形成。良好的樣本準(zhǔn)備能夠：

1. 提高細(xì)胞存活率：避免因離子濃度過(guò)高造成的過(guò)度放電或熱損傷；

2. 提高轉(zhuǎn)化效率：確保DNA能順利進(jìn)入細(xì)胞并在復(fù)蘇期完成整合；

3. 減少實(shí)驗(yàn)誤差：提高不同實(shí)驗(yàn)間的重復(fù)性和可比性；

4. 延長(zhǎng)儀器壽命：防止電弧放電造成電極損傷。

三、樣本準(zhǔn)備的總體要求

在 Gene Pulser Xcell 系統(tǒng)中，樣本準(zhǔn)備需遵循以下總體要求：

1. 低電導(dǎo)率：樣品溶液必須去離子化，避免鹽分殘留；

2. 低溫操作：操作應(yīng)在冰上完成，保持4℃環(huán)境以減少細(xì)胞應(yīng)激；

3. 無(wú)氣泡與雜質(zhì)：氣泡會(huì)導(dǎo)致電場(chǎng)集中，引起電弧；

4. 均勻混合：DNA或RNA與感受態(tài)細(xì)胞應(yīng)充分混勻但避免劇烈震蕩；

5. 快速處理：混合樣品應(yīng)立即進(jìn)行電擊，防止膜電位變化失衡。

四、樣本類(lèi)型分類(lèi)與特點(diǎn)

1. 細(xì)菌樣本

以大腸桿菌（E. coli）為代表的原核細(xì)胞體積小、膜厚、對(duì)電擊耐受性高。
特點(diǎn)：

• 易制備高活性感受態(tài)；

• 轉(zhuǎn)化效率受鹽濃度與電場(chǎng)強(qiáng)度影響明顯；

• 使用 0.1 cm 或 0.2 cm 電穿孔杯效果較好。

2. 酵母及真菌樣本

細(xì)胞壁較厚，導(dǎo)入效率低于細(xì)菌，但可通過(guò)酶解預(yù)處理改善。
特點(diǎn)：

• 需去除細(xì)胞壁或使用酶解法形成原生質(zhì)體；

• 含高滲保護(hù)劑（如山梨醇、甘露醇）以維持形態(tài)；

• 電壓與電容需高于細(xì)菌體系。

3. 哺乳動(dòng)物細(xì)胞

膜結(jié)構(gòu)脆弱，對(duì)電擊極為敏感。
特點(diǎn)：

• 需在等滲緩沖液中處理；

• 方波模式優(yōu)于指數(shù)衰減波；

• 電擊后迅速?gòu)?fù)蘇以提高存活率。

4. 植物原生質(zhì)體

去壁細(xì)胞，體積大，需中強(qiáng)度電場(chǎng)。
特點(diǎn)：

• 操作環(huán)境需高滲；

• 細(xì)胞數(shù)量控制精確；

• 電擊后需補(bǔ)充Ca2?促進(jìn)膜修復(fù)。

五、感受態(tài)細(xì)胞制備

1. 細(xì)菌感受態(tài)

以大腸桿菌為例：

步驟

1. 取單克隆菌落接種入5 mL LB液體培養(yǎng)基，37℃振蕩過(guò)夜；

2. 次日1:100比例接種入新鮮LB培養(yǎng)基；

3. 培養(yǎng)至OD600≈0.5（對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期）；

4. 置冰上冷卻10 min以抑制代謝；

5. 4℃、4000 rpm離心10 min，棄上清；

6. 用預(yù)冷無(wú)菌10%甘油溶液洗滌三次；

7. 最終重懸于少量10%甘油中（約2×10? cells/mL）；

8. 分裝至無(wú)菌離心管，置冰上待用或-80℃保存。

注意事項(xiàng)

• 培養(yǎng)基必須不含鹽（NaCl等）殘留；

• 洗滌液使用無(wú)離子甘油可顯著降低電導(dǎo)；

• 細(xì)胞狀態(tài)對(duì)電轉(zhuǎn)化效率影響顯著，過(guò)老或過(guò)嫩均不宜使用。

2. 酵母感受態(tài)

步驟

1. 培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期，離心收集細(xì)胞；

2. 用1.2 M山梨醇緩沖液洗滌2次；

3. 以溶壁酶或Zymolyase處理30 min制備原生質(zhì)體；

4. 再次離心洗滌并重懸于高滲緩沖液中；

5. 置冰上備用。

要點(diǎn)

• 原生質(zhì)體制備需在無(wú)菌條件下完成；

• 電穿孔時(shí)液體體積控制在40–60 μL；

• 電擊后立即加入山梨醇復(fù)蘇液防止破裂。

3. 動(dòng)物細(xì)胞樣本

準(zhǔn)備步驟

1. 將細(xì)胞培養(yǎng)至70–80%融合度；

2. 使用胰酶輕柔消化，離心收集；

3. 用無(wú)Ca2?、無(wú)Mg2? PBS洗滌2次；

4. 重懸于等滲電穿孔緩沖液（如Cytoporation Buffer）中；

5. 計(jì)數(shù)調(diào)整至1×10? cells/mL；

6. 放置冰上備用。

注意事項(xiàng)

• 避免細(xì)胞聚集或氣泡；

• 所有緩沖液需過(guò)濾除菌；

• 不可使用含血清或鹽分高的培養(yǎng)液。

六、核酸樣品準(zhǔn)備

1. 質(zhì)粒DNA

電穿孔對(duì)DNA純度要求極高。
要求與處理：

• 純度A260/A280應(yīng)在1.8–2.0；

• 徹底脫鹽，避免任何Tris、NaCl、EDTA殘留；

• 溶解介質(zhì)推薦無(wú)離子水或低離子緩沖液（如TE 1:100稀釋?zhuān)?/p>

• 儲(chǔ)存于-20℃，使用前置冰解凍。

濃度建議

• 對(duì)細(xì)菌：10–100 ng/μL；

• 對(duì)動(dòng)物細(xì)胞：1–5 μg/mL；

• 過(guò)高濃度會(huì)導(dǎo)致電導(dǎo)率上升，增加電弧風(fēng)險(xiǎn)。

2. RNA與蛋白樣品

RNA或蛋白轉(zhuǎn)染樣品應(yīng)保持結(jié)構(gòu)完整。

• RNA樣品需避免RNase污染；

• 蛋白樣品應(yīng)保持緩沖液電導(dǎo)率低且pH 7.0–7.4；

• 可在電擊前加入穩(wěn)定劑如甘油或蔗糖以保護(hù)樣品。

七、混合與上樣

1. 混合比例

一般情況下，DNA與感受態(tài)細(xì)胞體積比例為1:20至1:40。
例如：

• 40 μL細(xì)胞 + 1–2 μL DNA。

2. 操作步驟

1. 將感受態(tài)細(xì)胞加入至預(yù)冷電穿孔杯；

2. 加入DNA樣品輕輕混勻；

3. 確保液面平整無(wú)氣泡；

4. 放置冰上待電擊，不超過(guò)2分鐘。

3. 關(guān)鍵要點(diǎn)

• 所有操作均應(yīng)在冰上完成；

• 混合后應(yīng)立即進(jìn)行電擊；

• 若出現(xiàn)氣泡，應(yīng)棄樣重新配制。

八、樣品溫度與離子控制

電穿孔過(guò)程中能量釋放迅速，會(huì)導(dǎo)致局部加熱。若樣本溫度過(guò)高，細(xì)胞會(huì)迅速死亡。
溫度控制措施：

• 電擊前樣品保持在0–4℃；

• 電擊后立即加入預(yù)溫復(fù)蘇液（37℃），避免溫差沖擊；

• 每次電擊間隔至少5分鐘，使電極降溫。

離子濃度控制：

• 使用去離子水或低離子甘油溶液制備細(xì)胞懸液；

• 避免NaCl、KCl、Tris等強(qiáng)電解質(zhì)；

• 若必須加入離子組分，應(yīng)控制在1–5 mM以下。

九、電穿孔后的樣品處理

1. 立即復(fù)蘇
   電擊結(jié)束后，在杯中迅速加入1 mL預(yù)溫SOC或特定復(fù)蘇液；

2. 輕柔混勻
   避免劇烈搖動(dòng)，防止受損細(xì)胞破裂；

3. 復(fù)蘇培養(yǎng)

• 對(duì)細(xì)菌：37℃搖床復(fù)蘇1小時(shí)；

• 對(duì)動(dòng)物細(xì)胞：37℃、5% CO?培養(yǎng)2–4小時(shí)后更換新培養(yǎng)基；

4. 檢測(cè)與保存

• 電轉(zhuǎn)后取部分樣品接種平板驗(yàn)證陽(yáng)性克??；

• 余下樣品可冷凍保存以供分析。

十、常見(jiàn)問(wèn)題與解決方案

十一、實(shí)驗(yàn)記錄與質(zhì)量控制

在樣本準(zhǔn)備過(guò)程中，應(yīng)建立詳細(xì)記錄表，包括：

• 樣品編號(hào)與制備時(shí)間；

• 感受態(tài)細(xì)胞OD值與保存條件；

• DNA濃度與純度；

• 電擊參數(shù)及時(shí)間常數(shù)；

• 電擊前后樣品體積與溫度。

記錄數(shù)據(jù)用于質(zhì)量追蹤與后期實(shí)驗(yàn)優(yōu)化。

十二、樣本準(zhǔn)備的自動(dòng)化與優(yōu)化方向

隨著實(shí)驗(yàn)室自動(dòng)化的發(fā)展，部分樣本制備流程已可通過(guò)機(jī)器人系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)。
未來(lái)優(yōu)化方向包括：

1. 自動(dòng)溫控與攪拌系統(tǒng)：確?；旌暇鶆蚯覝囟群愣?；

2. 微流控上樣系統(tǒng)：精確控制電場(chǎng)作用體積；

3. 低離子仿生緩沖液：在保持生理穩(wěn)定的同時(shí)減少電導(dǎo)率；

4. 預(yù)警檢測(cè)機(jī)制：實(shí)時(shí)監(jiān)控導(dǎo)電率與溫度，防止電弧。

十三、廠家服務(wù)與技術(shù)支持

長(zhǎng)沙實(shí)了個(gè)驗(yàn)儀器制造有限公司 為伯樂(lè) Gene Pulser Xcell 系列設(shè)備的授權(quán)技術(shù)服務(wù)單位，提供：

• 原廠耗材供應(yīng)與電穿孔杯更換；

• 樣品制備指導(dǎo)與標(biāo)準(zhǔn)操作培訓(xùn)；

• 定期校正與性能檢測(cè)；

• 三年質(zhì)保，只換不修，確保實(shí)驗(yàn)安全高效；

• 提供定制化參數(shù)優(yōu)化方案。

該服務(wù)體系確保科研人員在樣本準(zhǔn)備與儀器使用全過(guò)程中獲得專(zhuān)業(yè)技術(shù)保障。

十四、總結(jié)

樣本準(zhǔn)備是電穿孔實(shí)驗(yàn)的核心環(huán)節(jié)。無(wú)論是細(xì)胞活性、DNA純度、緩沖液組成，還是溫度與離子濃度的控制，均直接影響導(dǎo)入效果。

通過(guò)科學(xué)、系統(tǒng)的準(zhǔn)備流程，可顯著提升實(shí)驗(yàn)穩(wěn)定性與轉(zhuǎn)化效率。Gene Pulser Xcell 電穿孔儀憑借精準(zhǔn)的脈沖控制與可靠的硬件系統(tǒng)，為各種細(xì)胞類(lèi)型的基因?qū)胩峁├硐肫脚_(tái)。在廠家長(zhǎng)沙實(shí)了個(gè)驗(yàn)儀器制造有限公司的技術(shù)支持與質(zhì)保體系下，研究人員能夠安全、穩(wěn)定地開(kāi)展長(zhǎng)期實(shí)驗(yàn)工作，確保數(shù)據(jù)真實(shí)可靠。