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伯樂（Bio-Rad）電穿孔儀165-2661是一款集精確控制、高效能量釋放與智能化管理于一體的高性能電轉化設備，主要用于DNA、RNA或蛋白質在細胞內的導入實驗。該儀器可產生受控高壓脈沖，瞬間改變細胞膜的電勢狀態，形成可逆性納米孔洞，從而實現分子跨膜運輸。
165-2661型號在電壓調節精度、電容釋放穩定性、時間常數檢測及安全防護方面均較前代產品有顯著提升。其操作系統設計簡潔，具備自動檢測、數據記錄、參數存儲及錯誤報警功能，適用于細菌、酵母、哺乳動物細胞和植物原生質體等多種體系。
本教程旨在詳細介紹伯樂165-2661的操作步驟、實驗流程、參數設置、樣品準備及注意事項，幫助科研人員掌握標準化實驗操作流程，實現高效、安全、可重復的實驗結果。
165-2661電穿孔儀主要由以下部分構成：
主機系統：控制電壓、電容及時間常數的核心模塊。
高壓儲能與放電系統：用于能量積累與脈沖釋放。
電極輸出接口：連接電轉杯并傳導能量。
顯示與控制面板：設置實驗參數與實時顯示狀態。
安全防護模塊：包括電弧檢測、安全蓋感應與過壓保護。
散熱系統：維持內部溫度穩定。
儀器結構緊湊，參數調節采用數字化控制，所有關鍵數據均通過LCD屏實時顯示，確保操作可視化與可追溯。
溫度范圍：20–25°C；
相對濕度：≤60%；
電源電壓：AC 220 V ±10%；
接地電阻：≤1 Ω；
環境應無強磁場、導電塵埃及振動源。
在開機前，操作人員應完成以下檢查：
確認電源線完好且接地可靠；
檢查電極接口及電轉杯是否干燥、清潔；
確認安全蓋感應裝置正常；
檢查面板是否顯示“Ready”；
確保電源插座不與其他高功率設備共用。
以大腸桿菌為例，樣品制備過程如下：
接種菌株于LB培養基中，37°C培養至OD???≈0.4；
離心（4000 rpm，5分鐘），去上清；
使用冰冷10%甘油溶液洗滌3次，去除培養基鹽分；
將菌體重懸于10%甘油中，濃度約1×10? cells/mL；
加入外源質粒DNA（1–2 μg）；
冰上預冷5分鐘備用。
對于哺乳動物細胞，可采用無血清緩沖液（如Opti-MEM）重懸，并保持低溫操作。
打開電源開關，儀器進入啟動自檢狀態；
系統檢測高壓模塊、電容組、安全蓋感應器及電極連接狀態；
若顯示“Ready to Pulse”，表示可進入操作階段；
若出現“Check System”提示，應檢查安全蓋或電極接觸是否異常。
自檢通過后，系統自動進入主界面，顯示默認電壓、電容與時間常數值。
按下“VOLTAGE”鍵，使用方向鍵輸入所需電壓。
電壓范圍：0.2–2.5 kV；
分辨率：0.01 kV；
建議設置：
細菌體系：2.0–2.5 kV；
酵母體系：1.0–1.5 kV；
哺乳細胞：0.25–0.8 kV；
植物原生質體：0.8–1.0 kV。
按下“CAP”鍵選擇所需電容檔位（25–3300 μF）。
小電容：用于細菌或短脈沖放電；
中等電容：用于真核細胞或中能量體系；
大電容：用于植物細胞或大體積電擊實驗。
單脈沖模式（Single Pulse）：適合細菌與酵母；
多脈沖模式（Multi Pulse）：適合哺乳動物細胞，增強DNA導入效率；
程序模式（Program Mode）：可調用已保存參數組。
設定完成后，按“ENTER”鍵確認，屏幕顯示設定參數；
如需保存當前方案，按“SAVE”，系統自動編號并記錄。
取預冷電轉杯（0.2 cm間隙）置于冰上；
吸取40–50 μL樣品混合液加入電轉杯；
輕拍電轉杯底部以排除氣泡；
將電轉杯插入儀器電極槽中，確保接觸良好；
關閉安全蓋。
按下“PULSE”鍵啟動放電；
儀器自動釋放儲能電量并顯示放電狀態；
屏幕實時顯示：
實際電壓值（V）；
時間常數τ（ms）；
電弧檢測狀態（OK或ARC）；
放電完成后，系統發出提示音并顯示“Pulse Complete”。
正常放電：時間常數為4–8 ms，顯示“OK”；
異常電弧：顯示“ARC DETECTED”，需重新制備樣品；
電流中斷：可能因安全蓋未閉合或電極接觸不良，應重新檢測。
取出電轉杯并立即置于冰上冷卻2分鐘；
向電轉杯中加入1 mL冰冷SOC復蘇培養基；
將混合液轉移至無菌離心管中；
37°C培養1小時以恢復細胞；
涂布含抗性標記的培養基平板并培養12–16小時；
觀察轉化菌落或進行后續篩選。
哺乳細胞體系需在無血清條件下復蘇4小時后更換完全培養基。
防止電弧放電
樣品中不得含鹽；
電轉杯內無氣泡；
電極表面保持干燥。
控制溫度
所有樣品與電轉杯需預冷；
放電后立即冰浴處理。
電壓與電容匹配
電壓過高或電容過大會導致細胞膜不可逆損傷；
建議通過小范圍預實驗優化。
安全防護
放電過程中不得觸碰儀器；
儀器必須可靠接地；
若設備出現異響或冒煙，應立即斷電。
多次實驗間隔
每次放電間隔≥30秒，以防電容過熱。
165-2661可實時記錄實驗數據，包括：
放電電壓；
電容值；
時間常數；
電弧檢測狀態；
實際放電曲線。
按下“VIEW”鍵查看上一次放電記錄；
可通過USB接口導出數據文件（TXT或CSV格式）；
建議建立實驗記錄表，包括樣品編號、參數組合及結果分析。
標準記錄示例：
| 樣品編號 | 電壓 (kV) | 電容 (μF) | 時間常數 (ms) | 電弧狀態 | 備注 |
|---|---|---|---|---|---|
| E001 | 2.5 | 25 | 4.8 | OK | 正常放電 |
| E002 | 2.5 | 25 | ARC | 電弧，樣品含鹽 |
關閉電源，待風扇停止后拔出電源插頭；
用無水乙醇或去離子水清潔電極槽；
擦干儀器表面，保持通風干燥；
電轉杯清洗后晾干備用。
| 項目 | 周期 | 內容 |
|---|---|---|
| 電極清潔 | 每次實驗后 | 去除殘液與污染物 |
| 風扇與散熱系統 | 每月 | 清除灰塵，保持通風 |
| 電壓校準 | 每6個月 | 使用標準高壓表檢測 |
| 電容檢測 | 每年 | 檢查容量衰減 |
| 安全蓋感應 | 每季度 | 檢查靈敏度與可靠性 |
| 問題 | 可能原因 | 解決方法 |
|---|---|---|
| 無法放電 | 安全蓋未關閉或接地異常 | 檢查蓋體與接地系統 |
| 電弧頻繁 | 樣品含鹽或氣泡 | 更換緩沖液并重新配制樣品 |
| 時間常數偏低 | 電導率過高 | 稀釋樣品或更換電轉杯 |
| 電壓偏差大 | 內部電源不穩 | 檢查電源或聯系維護人員 |
| 樣品過熱 | 連續放電過多 | 延長操作間隔并冰浴降溫 |
細胞狀態
細胞應處于生長對數期，過度培養會降低電穿孔效率。
DNA純度
使用高純度質粒DNA，A???/A???應在1.8–2.0之間。
緩沖液導電性
理想導電率≤10 μS/cm，過高會導致電弧。
能量調控
通過調節電壓或電容微調能量密度，平衡轉化效率與細胞存活率。
重復性驗證
同一參數下進行3次獨立放電，若時間常數偏差<0.2 ms，則條件穩定。
設備運行期間禁止打開安全蓋或接觸電極；
若儀器報警，應立即停止操作并關閉電源；
實驗室應配備干粉滅火器、防電擊絕緣墊與急救設施；
操作人員須接受高壓設備培訓；
定期進行安全檢查與電氣檢測。
電穿孔成功的關鍵指標包括：
細胞存活率高于80%；
無電弧放電；
轉化效率達到預期標準（如>10? CFU/μg DNA）；
時間常數穩定在理論值±0.2 ms范圍內。
若結果偏差明顯，應重新評估緩沖液成分、電極清潔度及能量參數。
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