現貨現發隔天到達
真人真事真本事
咨詢熱線13158823830
咨詢熱線13158823830
伯樂（Bio-Rad）電穿孔儀165-2661是一款高精度的電轉化儀，用于通過高壓瞬時脈沖使細胞膜形成可逆性孔洞，從而實現外源DNA、RNA或蛋白質的高效導入。
本實驗旨在利用165-2661進行細胞電穿孔實驗，通過科學的參數設定和樣品處理流程，探索不同電場強度與時間常數對細胞轉化效率、存活率及電弧發生率的影響，從而驗證該儀器的性能穩定性與可重復性。
實驗報告的目標包括：
建立標準化的165-2661電穿孔實驗流程；
分析不同電壓與電容組合的能量釋放特征；
評估電穿孔在細菌與真核細胞體系中的應用效果；
對實驗數據進行統計分析與優化建議。
電穿孔技術的核心在于電場誘導的膜電位變化。
當外加電場作用于細胞時，細胞膜兩側會形成跨膜電位差，當電壓超過一定閾值時，膜結構發生局部重排形成納米級孔洞。
外源分子借助電場力穿過膜孔進入細胞，電場撤除后膜孔關閉，細胞恢復原狀。
電場強度與時間常數（τ）的關系決定了穿孔效果：
E=Vd,τ=R×CE = \frac{V}pnbn5h5, \quad \tau = R \times CE=dV,τ=R×C
其中，V為電壓，d為電極間距，R為樣品電阻，C為電容。
電壓控制穿孔孔徑的形成；
電容影響能量釋放時間；
樣品導電性決定時間常數；
電極間距影響電場分布均勻性。
合理匹配這些參數，可在保證細胞活性的前提下實現高效率的基因導入。
伯樂電穿孔儀165-2661主機
電轉杯（間隙0.1 cm、0.2 cm、0.4 cm）
微量移液器及吸頭
恒溫培養箱、冰浴裝置
分光光度計與顯微鏡
E. coli DH5α感受態細胞
HEK293哺乳動物細胞
pUC19質粒DNA（濃度：50 ng/μL）
10%甘油溶液
Opti-MEM低離子緩沖液
SOC培養基與抗生素平板
室溫：22°C
相對濕度：50%
電源電壓：220V ±5%，接地電阻≤1 Ω
為驗證165-2661在不同體系中的表現，本實驗設計兩類實驗體系：
| 體系類型 | 電極間隙 | 電容 (μF) | 電壓 (kV) | 目標 |
|---|---|---|---|---|
| A組（細菌） | 0.2 cm | 25 | 2.0, 2.3, 2.5 | 測定轉化效率 |
| B組（哺乳動物細胞） | 0.1 cm | 250 | 0.25, 0.5, 0.8 | 測定存活率與表達率 |
樣品制備：細胞洗滌3次以去除鹽離子；
參數設定：根據實驗組輸入電壓、電容、模式；
放電操作：置入電轉杯后按“PULSE”鍵；
復蘇與培養：加入培養基恢復；
結果檢測：統計陽性克隆或熒光表達細胞比例。
樣品體積：100 μL；
DNA濃度：50 ng/μL；
電轉前預冷溫度：4°C；
放電后復蘇時間：60 min（細菌），2 h（細胞）。
開機自檢后，儀器顯示“READY TO PULSE”狀態。確認電極接口清潔且電轉杯無氣泡。
細菌體系：設定電壓2.5 kV，電容25 μF；
哺乳細胞體系：設定電壓0.5 kV，電容250 μF，多脈沖模式（3次脈沖，間隔2秒）。
樣品置入電極槽后，關閉安全蓋并執行放電。
屏幕自動顯示時間常數與狀態信息：
vbnet復制編輯VOLTAGE: 2.50 kV
CAP: 25 μF
TIME CONST: 4.9 ms
ARC: NONE
立即取出電轉杯并置冰上，隨后將樣品加入復蘇培養基中。
細菌在37°C搖床中復蘇1小時后涂布平板；哺乳動物細胞轉入培養皿中靜置培養。
| 實驗編號 | 電壓 (kV) | 電容 (μF) | 時間常數 (ms) | 電弧狀態 |
|---|---|---|---|---|
| A1 | 2.0 | 25 | 4.5 | NONE |
| A2 | 2.3 | 25 | 4.8 | NONE |
| A3 | 2.5 | 25 | 5.0 | NONE |
| B1 | 0.25 | 250 | 15 | NONE |
| B2 | 0.50 | 250 | 20 | NONE |
| B3 | 0.80 | 250 | 25 | NONE |
時間常數波動小于±0.2 ms，說明儀器放電穩定性良好。
| 體系 | 電壓 (kV) | 轉化效率 (CFU/μg DNA) | 存活率 (%) |
|---|---|---|---|
| A1 | 2.0 | 2.8×10? | 97 |
| A2 | 2.3 | 3.4×10? | 93 |
| A3 | 2.5 | 3.7×10? | 89 |
| B1 | 0.25 | — | 96 |
| B2 | 0.50 | — | 91 |
| B3 | 0.80 | — | 85 |
結果顯示，隨著電壓上升，轉化效率提高但細胞活性略有下降。
哺乳動物細胞在0.5 kV時獲得平衡效果。
通過熒光顯微鏡觀察GFP表達情況，綠色熒光陽性率如下：
| 電壓 (kV) | 陽性表達率 (%) |
|---|---|
| 0.25 | 18 |
| 0.50 | 41 |
| 0.80 | 52 |
熒光結果表明0.5–0.8 kV條件下基因導入效率顯著提升，但高電壓會導致部分細胞形態受損。
根據公式：
E=12CV2E = \frac{1}{2} C V^2E=21CV2
能量隨電壓平方增長。例如在25 μF電容下：
2.0 kV能量為50 mJ；
2.5 kV能量為78 mJ。
能量增加提高了膜孔數量與孔徑，但同時引發細胞熱應激。
細菌對電壓耐受性高，而真核細胞需保持溫和條件以防膜損傷。
理想電穿孔需保持τ值穩定，反映設備放電均勻性。
本實驗中，τ值波動<4%，符合高精度儀器要求。
這說明165-2661的電容儲能系統穩定，放電輸出一致。
在所有實驗中未出現“ARC DETECTED”提示，表明樣品導電性控制良好。
電弧通常由高離子溶液或氣泡引起，因此嚴格樣品處理可顯著降低風險。
細菌體系：電壓提升可顯著提高轉化效率，2.3 kV為最優點；
哺乳細胞體系：多脈沖模式下可平衡效率與生存率；
電場強度影響：電極間距越小，所需電壓越低；
能量分布穩定性：在多次實驗中重復誤差低于10%，表明儀器輸出一致。
| 指標 | 實驗結果 | 評價 |
|---|---|---|
| 電壓輸出誤差 | ≤±1% | 優良 |
| 時間常數穩定性 | ±0.2 ms | 優良 |
| 放電重復性 | CV ≤2% | 穩定 |
| 電弧發生率 | 0% | 優良 |
| 樣品生存率 | ≥85% | 滿足要求 |
總體結果表明：165-2661設備性能穩定、能量釋放精準，能夠在多體系中實現高重復性與安全電擊操作。
樣品電導率波動：若緩沖液殘留離子，會造成時間常數偏低；
氣泡殘留：可能導致局部電場集中，引發微電弧；
溫度控制：實驗環境高溫可能加快細胞膜破裂；
DNA質量：雜質會降低導入效率；
操作速度：放電后冷卻延遲將降低復蘇成功率。
使用低離子濃度緩沖液（導電率≤10 μS/cm）；
電轉前預冷樣品，降低電弧概率；
避免氣泡產生，確保電場均勻；
哺乳細胞體系中采用多脈沖模式；
定期校準儀器電壓與電容，保持輸出精度；
實驗后立即復蘇細胞，減少電擊后損傷。
伯樂電穿孔儀165-2661在本實驗中表現出高精度、高重復性和優良的能量控制性能。
在不同實驗體系下，設備均能實現穩定的時間常數與電壓輸出，且無異常放電現象。
主要結論如下：
細菌體系最佳參數為2.3 kV、25 μF、時間常數4.8 ms；
哺乳細胞體系在0.5 kV、250 μF條件下實現最佳轉染效率與生存率平衡；
電壓輸出誤差低于±1%，時間常數重復性高于98%；
電弧檢測系統有效，實驗安全性高。
伯樂165-2661能夠長期維持穩定輸出，在高效基因導入與細胞研究中具有廣泛應用前景。
| 日期 | 體系 | 電壓 (kV) | 電容 (μF) | 時間常數 (ms) | 電弧 | 轉化效率 | 存活率 (%) | 操作員 |
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| 2025-10-25 | E. coli | 2.3 | 25 | 4.8 | NONE | 3.4×10? | 93 | 王凱 |
| 2025-10-25 | HEK293 | 0.5 | 250 | 20 | NONE | — | 91 | 王凱 |
| 2025-10-26 | HEK293 | 0.8 | 250 | 25 | NONE | — | 85 | 王凱 |
杭州實了個驗生物科技有限公司
