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伯樂（Bio-Rad）電穿孔儀165-2660是一款精密的電轉化設備，用于將外源DNA、RNA或蛋白質分子導入細胞、原生質體或組織樣品中。該儀器通過在細胞膜上施加瞬時高壓脈沖，產生可逆性納米級孔洞，使分子能夠透過細胞膜進入胞內，從而實現基因轉化或轉染。
作為國際實驗室廣泛使用的標準設備之一，165-2660以其高精度電壓控制、寬范圍電容可調與卓越的時間常數穩定性著稱。為了確保實驗的高效性與結果的可重復性，嚴格遵循規范化的操作流程至關重要。
本操作指南將從設備準備、參數設定、樣品處理、放電操作、數據記錄及安全收尾等環節，系統闡述165-2660的標準化操作步驟，幫助研究人員高效、安全地完成電穿孔實驗。
溫度要求：20–25°C
濕度要求：≤60%
電源規格：220V ±10%，50/60Hz，接地良好
操作臺要求：干燥、平穩、無金屬裸露與液體濺灑
照明條件：環境光充足，以便觀察電極與顯示狀態
實驗環境應避免高濕或強磁干擾，設備周圍保持至少30 cm的通風間距。
在正式實驗前應進行全面設備檢查：
| 檢查項目 | 要求 | 說明 |
|---|---|---|
| 電源線連接 | 穩固無松動 | 確保接地良好 |
| 顯示屏狀態 | 無閃爍與異常字符 | 若不亮需檢查保險絲 |
| 電轉杯接口 | 清潔干燥無鹽分 | 避免電弧放電 |
| 安全蓋 | 感應正常 | 未閉合則儀器無法放電 |
| 按鍵與旋鈕 | 反饋靈敏 | 任何延遲需校修 |
| 內部風扇 | 運行正常 | 防止過熱 |
儀器通電后進行自檢，若屏幕顯示“Ready”，則系統正常。
電轉杯：標準規格0.1 cm、0.2 cm、0.4 cm，根據實驗選擇；
細胞樣品：對數生長期細胞；
緩沖液：低離子強度緩沖液（如1 mM HEPES）；
DNA/RNA溶液：純度高、無鹽殘留；
無菌移液器與吸頭：防止污染；
冰浴或冷卻模塊：用于放電前冷卻樣品。
樣品應預冷至4°C，以減少電穿孔過程中熱效應帶來的細胞損傷。
連接電源與接地線。
確認接地端牢固，以防靜電或電壓泄漏。
按下電源鍵，設備自動進入自檢程序。
觀察顯示屏提示：若顯示“System Ready”，則設備可操作；若出現“Check System”或“Error”，需重新啟動或聯系技術維護。
確保安全蓋處于開啟狀態，便于安裝電轉杯。
按下“Set”或“Parameter”鍵，進入設置模式。使用旋鈕或數字鍵輸入參數值。
范圍：0.2–2.5 kV
調節精度：0.01 kV
建議設置：
細菌：2.3–2.5 kV
酵母：1.0–1.5 kV
哺乳細胞：0.25–0.8 kV
植物原生質體：0.6–1.0 kV
電壓過高可能引起電弧，過低則無法形成足夠電場。
范圍：25–3300 μF
推薦設置：
細菌：25 μF
酵母：50 μF
哺乳細胞：250 μF
植物原生質體：1000 μF
電容控制能量儲存量，需與樣品類型匹配。
伯樂165-2660采用指數衰減放電。時間常數（τ）表示能量釋放速率，單位為毫秒（ms）。系統會在放電后自動計算實際τ值。
理想范圍：4–10 ms。
設備可保存多組實驗程序，設置完成后按“Store”鍵保存參數組合，以便重復使用。
在無菌條件下，將DNA或RNA加入預處理細胞懸液中：
混合后輕輕吹打均勻，避免氣泡；
總體積約為80–100 μL（適用于0.2 cm電轉杯）；
樣品濃度：1×10? cells/mL。
使用前徹底清潔并干燥；
若為一次性杯體，拆封后立即使用；
裝樣時液面應覆蓋電極板。
將裝好樣品的電轉杯置于冰上或冷卻模塊中冷卻1分鐘。
冷卻可防止熱積累造成細胞膜破裂。
打開安全蓋；
將電轉杯插入電極槽，確保卡入定位槽；
關閉安全蓋，系統顯示“Ready for Pulse”。
按下“Pulse”鍵啟動放電；
放電瞬間，顯示屏同步顯示實際電壓與時間常數；
放電結束后自動進入“Cooling”狀態，系統釋放殘余電荷；
當屏幕恢復顯示“Ready”，方可取出電轉杯。
整個放電過程持續時間極短（通常小于10毫秒），但能量釋放極為集中。
操作期間不得觸摸設備金屬部位；
確保安全蓋關閉，否則系統拒絕放電；
放電后等待至少10秒再取樣，避免殘余電荷。
放電后立即用無菌吸頭將樣品轉移至含適當培養基的離心管中。
若樣品為細菌，可加入SOC培養基（37°C復蘇1小時）。
若為哺乳細胞，則轉移至含血清培養基中靜置復蘇2小時。
| 樣品類型 | 復蘇培養基 | 時間 | 溫度 |
|---|---|---|---|
| 大腸桿菌 | SOC | 60分鐘 | 37°C |
| 酵母 | YPD | 45分鐘 | 30°C |
| 哺乳細胞 | DMEM + 10% FBS | 2小時 | 37°C |
| 植物原生質體 | W5溶液 | 12小時 | 25°C |
復蘇期間應避免劇烈震蕩，以利細胞膜修復。
實驗結束后，記錄設備顯示的時間常數（τ）。
標準參考范圍：
細菌：4–5 ms；
酵母：6–8 ms；
哺乳細胞：8–10 ms。
時間常數偏低說明放電過快或樣品電阻低，偏高則代表能量釋放過慢。
若出現“ARC DETECTED”提示，說明放電過程中發生電弧放電，可能由以下原因引起：
樣品中有氣泡；
電轉杯潮濕；
緩沖液離子濃度過高。
應重新制備樣品并清潔電轉杯后再試。
165-2660可自動存儲最近1000組實驗數據，包括：
電壓與電容設定值；
實測時間常數；
放電次數；
電弧狀態記錄。
數據可通過USB接口導出，以供統計分析。
放電時嚴禁開啟安全蓋；
使用絕緣手套操作高壓接口；
禁止在濕手條件下觸摸設備；
確保接地線連接可靠。
實驗后用無離子水清洗電極槽；
電轉杯可用70%乙醇消毒后自然晾干；
不得使用含氯清潔劑；
外殼用干布擦拭，防止積塵。
每6個月檢測電壓與電容輸出精度；
每12個月進行一次全面校準；
若長時間未使用，重新開機前應進行預熱10分鐘。
| 問題 | 可能原因 | 處理方式 |
|---|---|---|
| 無法放電 | 安全蓋未閉合 | 關閉蓋后重試 |
| 時間常數過短 | 電阻過小或緩沖液導電性高 | 使用低離子溶液 |
| 電弧放電 | 杯體潮濕或有氣泡 | 重新裝樣并排氣泡 |
| 樣品溫度升高 | 電容過大或放電頻繁 | 使用冷卻模塊或延長間隔 |
| 電壓偏差 | 模塊老化或電極腐蝕 | 校準電源模塊 |
| 顯示異常 | 控制電路受潮 | 關機晾干并檢查內部元件 |
關閉設備電源，待風扇停止后拔下電源線；
清理工作臺面與樣品殘留；
將儀器覆蓋防塵罩并存放于干燥處；
記錄實驗編號、參數與結果，建立電子檔案；
若出現異常放電或設備報警，應填寫維護記錄表并通知管理員。
為了確保實驗的科學性與一致性，需定期驗證設備性能：
放電穩定性測試：
連續10次相同條件放電，計算時間常數的平均值與標準差（SD < 0.2 ms）。
電壓精度驗證：
使用外部高壓計測量輸出電壓，偏差不得超過±1%。
轉化效率驗證：
使用標準樣品（如pUC19質粒與大腸桿菌DH5α）進行實驗，對比歷史轉化效率，應在正常范圍內波動（±10%）。
安全功能驗證：
在安全蓋打開狀態下測試放電鎖定功能，確保系統自動中斷。
實驗過程中，可根據樣品反應情況微調參數以獲得最佳結果：
| 樣品類型 | 建議電壓（kV） | 電容（μF） | 目標時間常數（ms） |
|---|---|---|---|
| 大腸桿菌 | 2.5 | 25 | 4.8 |
| 酵母 | 1.2 | 50 | 7.0 |
| 哺乳細胞 | 0.45 | 250 | 9.0 |
| 植物原生質體 | 0.8 | 1000 | 11.0 |
若轉化效率偏低，可微調電壓±0.1 kV或調整電容以延長時間常數。
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