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賽默飛熒光定量PCR儀使用方法

熒光定量PCR（Quantitative PCR, qPCR）是一種實時監(jiān)測PCR反應過程、對目標DNA或RNA進行定量分析的分子生物學技術。賽默飛（Thermo Fisher Scientific）作為全球知名的科研儀器制造商，其熒光定量PCR儀以性能穩(wěn)定、檢測靈敏度高和數據處理功能完善而廣泛應用于基礎科研、臨床檢測、食品安全、環(huán)境監(jiān)測等領域。為了確保實驗結果準確可靠，熟悉賽默飛熒光定量PCR儀的正確使用方法至關重要。

一、開機與系統(tǒng)檢查

1. 檢查電源與儀器狀態(tài)
   確保儀器連接穩(wěn)定的交流電源，避免與大功率設備共用插座，防止電壓波動影響實驗。
   儀器通風口保持暢通，避免堆放雜物。檢查儀器外觀和樣品槽是否清潔無異物。

2. 開機啟動
   按下電源鍵，等待系統(tǒng)自檢完成。啟動過程中，儀器會進行燈源、光路和溫控系統(tǒng)的自檢，如有異常會在顯示屏上提示。

3. 軟件連接
   若儀器為電腦控制型，需先啟動配套軟件（如Applied Biosystems? QuantStudio?系列軟件），確保與主機通訊正常。

二、實驗準備與耗材選擇

1. 試劑與耗材

• 選擇與儀器匹配的反應管、八聯(lián)管或96/384孔板，透明或半透明材質以保證熒光信號傳輸。

• 使用高質量光學平蓋膜或透明蓋，防止蒸發(fā)并減少熒光信號干擾。

• 反應體系中使用專用qPCR Master Mix、ROX參考染料（若體系需要）及高純度引物探針。

2. 樣品準備

• 模板DNA/RNA需純度高、無蛋白質或有機溶劑污染，A260/A280比值應在1.8–2.0之間。

• 若為RNA樣品，需經逆轉錄反應生成cDNA，并盡量減少凍融循環(huán)次數。

3. 工作區(qū)與防污染
   分區(qū)操作：試劑準備區(qū)、模板處理區(qū)、擴增檢測區(qū)分開，使用專用移液器及濾芯吸頭，防止氣溶膠交叉污染。

三、反應體系配置

1. 體系組成
   常用反應體系為10–50 μL，包括：

• 2× qPCR Master Mix：含Taq DNA聚合酶、dNTPs、MgCl?、緩沖液及熒光染料（SYBR Green或探針）

• 上下游引物（0.2–0.5 μM）

• 探針（若使用TaqMan等探針法，濃度一般為0.1–0.25 μM）

• 模板DNA/cDNA（通常為1–100 ng）

• 無RNAse/DNAse水補足體積

2. 配制步驟

• 先在冰上配置主混合液（Master Mix），將所有除模板外的成分混勻。

• 分裝至各反應管/孔中，再加入模板，輕輕混勻，避免產生氣泡。

• 封膜或加蓋，確保密封嚴實。

四、程序設定

1. 溫控程序
   根據實驗目的選擇程序模式。常規(guī)SYBR Green法典型程序：

   若為探針法，通常不需熔解曲線分析。

• 變性：95℃，10–15 s

• 退火/延伸：60℃，30–60 s（熒光采集）

• 預變性：95℃，2–10 min（激活Taq酶）

• 循環(huán)（40–45個循環(huán)）：

• 熔解曲線分析：從60℃逐漸升至95℃，每0.3–0.5℃采集一次熒光。

2. 熒光通道選擇

• SYBR Green法選擇FAM通道。

• 多重檢測需根據探針標記熒光素選擇不同通道（如 VIC、ROX、Cy5 等），并在軟件中正確設置。

3. 樣品信息錄入
   在軟件中建立板布局文件（Plate Layout），錄入樣品編號、分組、標準曲線濃度梯度等信息。

五、運行與監(jiān)控

1. 放置樣品

• 將反應管/板放入樣品槽中，位置對準，保持平衡。

• 使用平衡管補齊空位，避免熱不均。

2. 運行反應

• 在軟件中確認程序設置無誤，點擊“開始”運行。

• 反應過程中，實時熒光曲線會逐步生成，可監(jiān)控擴增情況。

3. 運行注意事項

• 實驗過程中盡量避免觸碰儀器，防止震動影響光路穩(wěn)定。

• 若發(fā)現(xiàn)異常曲線，可暫停并檢查樣品位置、光學元件是否清潔。

六、數據分析

1. 閾值與基線設置
   軟件可自動設定閾值和基線，也可根據對照組曲線人工調整，確保Ct值判定合理。

2. 擴增曲線解讀

• 正常曲線應呈S形，Ct值在重復孔間差異不超過0.5。

• 若曲線拖尾或有多個峰，可能存在引物二聚體或非特異性擴增。

3. 熔解曲線分析

• 單一尖銳峰表示擴增產物單一。

• 多峰或低溫峰提示有引物二聚體或非特異性產物。

4. 定量分析

• 絕對定量：根據標準曲線計算拷貝數。

• 相對定量：以內參基因（如GAPDH、β-actin）歸一化，使用2^-ΔΔCt方法計算表達倍數變化。

七、實驗結束與關機

1. 取出樣品
   反應結束后，戴手套取出反應管/板，避免接觸光學元件。

2. 清潔與維護

• 檢查樣品槽是否有溢液，如有立即用無水乙醇或專用清潔布擦拭。

• 光學透鏡保持清潔，避免用手直接觸碰。

3. 關機
   關閉軟件→關閉儀器電源→切斷電源總開關。
   若連續(xù)使用，可保持儀器待機狀態(tài)，減少燈源頻繁啟停。

八、常見問題與解決方法

九、安全注意事項

1. 避免直接暴露在熒光激發(fā)光下，保護眼睛。

2. 所有生物樣品均視為潛在感染源，需符合生物安全規(guī)范操作。

3. 使用化學染料和清潔劑時，注意佩戴手套、口罩。

十、使用技巧與優(yōu)化建議

1. 試劑預混：減少移液次數，降低系統(tǒng)誤差。

2. 板封膜前離心：去除氣泡，保證光路穩(wěn)定。

3. 多重定量優(yōu)化：盡量選擇熒光光譜分離度大的探針，減少通道串擾。

4. 溫度梯度預實驗：尋找最佳退火溫度，提高特異性。

5. 定期校準：建議每年進行溫控與光學系統(tǒng)的校準，保持檢測準確性。