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熒光定量聚合酶鏈式反應（qPCR，quantitative Polymerase Chain Reaction），是近年來分子生物學和臨床檢驗中應用最廣泛的技術之一。該技術通過對擴增產物的實時監測，定量分析特定DNA或RNA的表達水平，尤其在病毒載量檢測、基因表達分析、腫瘤標志物識別等方面發揮著核心作用。
與傳統PCR不同，熒光定量PCR在反應過程中加入了熒光染料或探針，隨著DNA擴增，熒光信號隨之增強，機器可實時捕捉每一循環的熒光強度變化，從而繪制擴增曲線并計算靶基因初始模板的數量。
熒光定量PCR主要依賴于兩個關鍵技術：擴增特異性和熒光信號采集。其工作流程包括：
模板準備：從組織、血液、唾液等樣本中提取DNA或RNA，并通過逆轉錄（如檢測mRNA）獲得cDNA。
反應體系建立：加入引物、熒光探針（如TaqMan或SYBR Green）、聚合酶和緩沖液。
熱循環擴增：在PCR儀中設置特定循環溫度，啟動鏈式擴增。
實時熒光監測：每個循環記錄熒光強度，形成擴增曲線，反映目標序列的相對或絕對數量。
在熒光定量PCR中，最核心的定量指標是“Ct值”（Threshold Cycle，閾值循環數）。它表示熒光信號首次超過背景值的循環次數。Ct值與目標模板初始濃度呈負相關，即模板越多，Ct值越小。
通常來說：
Ct值＜29：表明樣本中靶基因豐度較高。
Ct值30-35：表示中等豐度。
Ct值36-39：表示低拷貝數。
Ct值≥40：往往被認為是陰性或極低表達，需結合背景判斷。
熒光定量PCR本質上是一個定量工具，“正常值”需根據不同檢測目的、樣本類型和檢測靶標來具體分析。以下是幾種典型檢測項目的Ct值參考范圍和判斷標準：
HBV DNA陽性參考值：Ct值通常＜35被視為陽性；Ct＞38或未檢出為陰性。
HIV RNA載量檢測：Ct值在30以下，說明病毒復制活躍。
檢測結果需結合拷貝數/單位體積（如IU/mL）換算，Ct值本身并非通用標準。
一般Ct＜35為陽性，35-38為可疑，＞38為陰性。
同時檢測多個基因（如ORF1ab、N基因、E基因）以提高特異性。
某些癌癥相關基因突變（如EGFR、KRAS等）的Ct值閾值依廠商設定，一般＜32提示陽性突變存在。
靶向藥物療效評估、病情監測?；贑t值趨勢判斷而非單一值。
相對定量需引入內參基因（如GAPDH、ACTB），通過ΔCt（目標基因Ct - 內參Ct）或ΔΔCt計算表達倍數。
ΔCt穩定且一致性好說明實驗可靠。
不存在通用“正常值”，需以對照組為參考。
Ct值雖反映模板濃度，但易受到多種變量影響，必須嚴密控制實驗條件：
樣本質量：RNA降解、提取效率低下會導致Ct偏高。
反應體系誤差：酶失活、試劑污染、緩沖液pH偏移等都會造成假陰性或假陽性。
熒光探針選擇：SYBR Green對非特異性擴增敏感，而TaqMan探針則更具特異性。
操作規范性：吸樣不均、板孔污染等人為因素常影響重復性。
儀器校準問題：熒光通道漂移可能影響信號采集。
熒光定量PCR已成為多個臨床領域不可或缺的診斷工具，其結果解讀需根據具體臨床背景：
病毒核酸Ct值降低提示治療有效，反之提示復燃或耐藥。
陰陽性邊界值需結合癥狀、影像、血常規綜合判斷。
靶基因突變的Ct值有助于靶向藥物使用決策。
某些基因表達水平可預測預后或復發風險。
對某些單基因疾病的攜帶狀態檢測依賴高靈敏度Ct分析。
無創產前檢測中的染色體片段計數涉及Ct值精細比對。
在日常臨床或科研實踐中，規范的熒光定量PCR流程需嚴格遵守如下原則：
設置陰陽性對照：用于判斷是否污染或反應失敗。
重復檢測：Ct值波動較大的樣本建議重復檢測以確認結果。
溶解曲線分析（適用于SYBR Green）：判斷是否存在非特異性產物或引物二聚體。
熒光基線調整：正確設置基線范圍是獲得準確Ct值的關鍵。
實驗記錄詳盡：包括樣本編號、提取時間、批次信息等，便于追溯與分析。
熒光定量PCR作為一種高靈敏度、特異性強的核酸檢測技術，已成為現代分子診斷的重要工具。其核心指標Ct值并非固定“正常值”，而是根據檢測目的和背景判斷其生物學與臨床意義。掌握Ct值的科學解讀方法，結合全面的實驗與臨床資料，才能確保該技術的準確性與實用價值。
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