賽默飛ABI 7500實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀原理及應(yīng)用詳解

一、前言

ABI 7500實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀是由Applied Biosystems公司開發(fā)并由賽默飛（Thermo Fisher Scientific）整合運(yùn)營(yíng)的一款經(jīng)典qPCR平臺(tái)。自推出以來(lái)，該儀器憑借其優(yōu)良的性能表現(xiàn)、穩(wěn)定的熒光檢測(cè)系統(tǒng)、廣泛的適用性與成熟的軟件支持，成為全球科研機(jī)構(gòu)、臨床檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室以及生物技術(shù)企業(yè)廣泛使用的分子檢測(cè)工具。

ABI 7500以其精確的熒光定量能力、高度自動(dòng)化的操作界面和靈活的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)支持，已成為實(shí)時(shí)PCR技術(shù)在各類分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中應(yīng)用的標(biāo)志性設(shè)備之一。

二、基本原理

ABI 7500基于實(shí)時(shí)熒光定量PCR（Real-Time Quantitative PCR）技術(shù)工作，其核心是通過(guò)熒光染料或熒光探針實(shí)時(shí)監(jiān)控PCR擴(kuò)增反應(yīng)中目標(biāo)核酸的復(fù)制情況。熒光信號(hào)的強(qiáng)度與擴(kuò)增產(chǎn)物量直接相關(guān)，系統(tǒng)通過(guò)監(jiān)測(cè)每個(gè)循環(huán)中的熒光變化，推算出初始模板濃度。

1. 熒光信號(hào)監(jiān)測(cè)

在PCR反應(yīng)中，熒光信號(hào)通常通過(guò)以下兩種策略生成：

• 非特異性染料法（如SYBR Green）：與所有雙鏈DNA結(jié)合，當(dāng)擴(kuò)增產(chǎn)物形成時(shí)，熒光強(qiáng)度增強(qiáng)。

• 特異性探針?lè)?/strong>（如TaqMan探針）：探針結(jié)合靶序列，被Taq酶裂解釋放熒光基團(tuán)，產(chǎn)生特異性信號(hào)。

2. Ct值概念

Ct值（Cycle Threshold）指熒光信號(hào)首次顯著高于背景的循環(huán)數(shù)。Ct值越小，表明樣本中靶基因起始拷貝數(shù)越多，反之亦然。ABI 7500通過(guò)準(zhǔn)確測(cè)定Ct值，實(shí)現(xiàn)對(duì)核酸分子的絕對(duì)或相對(duì)定量分析。

3. 數(shù)據(jù)計(jì)算方法

• 絕對(duì)定量：建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，以Ct值對(duì)應(yīng)拷貝數(shù)。

• 相對(duì)定量：利用ΔCt或ΔΔCt方法，計(jì)算基因表達(dá)量相對(duì)于內(nèi)參基因或參照組的變化倍數(shù)。

三、儀器組成與結(jié)構(gòu)功能

ABI 7500主要由四大核心模塊構(gòu)成，分別負(fù)責(zé)樣品溫控、熒光采集、系統(tǒng)控制與軟件數(shù)據(jù)分析：

1. 熱循環(huán)模塊

• 樣本容量為96孔標(biāo)準(zhǔn)PCR反應(yīng)板。

• 加熱模塊采用高導(dǎo)熱金屬材質(zhì)，溫控準(zhǔn)確，升溫速率約為2.5℃/秒，滿足標(biāo)準(zhǔn)PCR程序。

• 溫度均勻性控制在±0.5℃，確保每個(gè)孔位反應(yīng)一致。

2. 熒光檢測(cè)系統(tǒng)

• 配備高靈敏度光學(xué)采集系統(tǒng)，支持多通道檢測(cè)，常見為FAM、VIC、ROX、SYBR、NED等。

• 采用光纖傳輸與CCD成像技術(shù)，熒光信號(hào)捕捉迅速且精確。

• 可實(shí)現(xiàn)多重反應(yīng)，一孔檢測(cè)多個(gè)靶標(biāo)，提高檢測(cè)效率。

3. 操作界面與控制模塊

• 控制系統(tǒng)通過(guò)計(jì)算機(jī)操作，兼容Windows操作環(huán)境。

• 軟件內(nèi)置標(biāo)準(zhǔn)操作流程模板，便于快速實(shí)驗(yàn)設(shè)置。

• 實(shí)驗(yàn)運(yùn)行中可實(shí)時(shí)顯示擴(kuò)增曲線和熒光變化圖，直觀掌握反應(yīng)過(guò)程。

4. 軟件分析平臺(tái)

• ABI 7500配套軟件支持定量分析、溶解曲線分析、基因分型、標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制等功能。

• 支持Excel、PDF等格式導(dǎo)出，便于統(tǒng)計(jì)分析與文檔歸檔。

• 提供實(shí)時(shí)質(zhì)控提示，協(xié)助用戶發(fā)現(xiàn)反應(yīng)異常或污染。

四、技術(shù)特點(diǎn)與優(yōu)勢(shì)

1. 靈敏度高

ABI 7500可檢測(cè)低至個(gè)位拷貝的核酸模板，適用于高靈敏度的樣本檢測(cè)需求，如病毒載量、殘余DNA檢測(cè)、單細(xì)胞分析等。

2. 多通道熒光檢測(cè)

支持多達(dá)5種熒光染料同時(shí)運(yùn)行，能夠?qū)崿F(xiàn)一孔多靶的多重反應(yīng)，大幅提升數(shù)據(jù)通量和實(shí)驗(yàn)效率。

3. 系統(tǒng)穩(wěn)定性強(qiáng)

儀器在連續(xù)高強(qiáng)度運(yùn)行環(huán)境下仍保持?jǐn)U增一致性，適合臨床實(shí)驗(yàn)室和生物樣本檢測(cè)中心的大批量檢測(cè)任務(wù)。

4. 軟件操作簡(jiǎn)便

無(wú)需編程基礎(chǔ)即可完成實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，圖形化界面、拖拽式設(shè)置，降低使用門檻，適合初學(xué)者與經(jīng)驗(yàn)用戶。

5. 良好的兼容性

開放式平臺(tái)，兼容絕大多數(shù)商業(yè)化試劑盒與通用耗材，無(wú)需專屬配套產(chǎn)品，節(jié)省實(shí)驗(yàn)成本。

五、典型應(yīng)用場(chǎng)景

ABI 7500廣泛應(yīng)用于科研和臨床領(lǐng)域，主要包括：

1. 基因表達(dá)分析

• 通過(guò)ΔΔCt方法評(píng)估不同處理、組織或時(shí)間點(diǎn)間的mRNA表達(dá)變化。

• 可用于疾病模型研究、藥物機(jī)制分析、基因調(diào)控研究等。

2. 病毒核酸檢測(cè)

• 適用于各種病毒如HBV、HCV、HIV、SARS-CoV-2等核酸載量的準(zhǔn)確測(cè)定。

• 常用于醫(yī)院、疾控中心的臨床診斷與流行病學(xué)研究。

3. 遺傳突變識(shí)別

• 配合TaqMan探針，識(shí)別SNP、插入缺失突變（INDEL）等遺傳位點(diǎn)。

• 適用于腫瘤分子分型、個(gè)體化用藥篩查、遺傳病基因攜帶檢測(cè)。

4. 基因分型

• 利用不同熒光探針同時(shí)檢測(cè)等位基因，進(jìn)行人群基因型分析。

• 常用于法醫(yī)DNA鑒定、親緣關(guān)系確認(rèn)、群體遺傳結(jié)構(gòu)研究。

5. 殘留DNA檢測(cè)

• 在生物制藥過(guò)程中監(jiān)測(cè)重組細(xì)胞殘留核酸，符合GMP質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

六、標(biāo)準(zhǔn)操作流程

ABI 7500的操作流程經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期優(yōu)化，保證高重復(fù)性與結(jié)果穩(wěn)定性，標(biāo)準(zhǔn)操作流程如下：

第一步：反應(yīng)體系準(zhǔn)備

• 提取DNA或RNA，純化并定量。

• 配制熒光PCR反應(yīng)液，包括引物、探針或染料、模板等。

第二步：樣品裝板

• 將反應(yīng)體系分裝至96孔PCR板，封板后輕離心去除氣泡。

第三步：程序設(shè)置

• 打開軟件，選擇合適的模板或自定義反應(yīng)程序與熒光通道。

• 設(shè)定反應(yīng)參數(shù)：變性溫度、退火溫度、循環(huán)次數(shù)等。

第四步：運(yùn)行實(shí)驗(yàn)

• 插入反應(yīng)板，啟動(dòng)程序，儀器自動(dòng)進(jìn)行熱循環(huán)與熒光監(jiān)測(cè)。

第五步：實(shí)時(shí)查看與數(shù)據(jù)分析

• 觀察擴(kuò)增曲線、熔解曲線（適用于SYBR Green法）判斷反應(yīng)狀態(tài)。

• 分析Ct值，計(jì)算表達(dá)倍數(shù)或載量，輸出定量結(jié)果圖表。

七、數(shù)據(jù)解讀與質(zhì)量控制

ABI 7500提供多層次數(shù)據(jù)質(zhì)量評(píng)估機(jī)制，幫助用戶判斷反應(yīng)是否成功：

• 擴(kuò)增曲線形態(tài)：標(biāo)準(zhǔn)S型曲線表明反應(yīng)正常；斜率過(guò)緩或平臺(tái)期波動(dòng)需注意模板質(zhì)量或反應(yīng)體系問(wèn)題。

• 熔解曲線分析：適用于SYBR Green法，單一峰值代表產(chǎn)物特異性好。

• 重復(fù)孔間差異：重復(fù)Ct值差值應(yīng)＜0.5，確保擴(kuò)增一致性。

• 陰陽(yáng)性對(duì)照分析：設(shè)置陽(yáng)性模板與陰性對(duì)照以判斷實(shí)驗(yàn)污染或體系失效。

八、維護(hù)與使用建議

為了保障ABI 7500長(zhǎng)期運(yùn)行穩(wěn)定，用戶在使用過(guò)程中應(yīng)注意：

• 定期清潔光路窗口與樣品槽，防止灰塵影響熒光信號(hào)。

• 使用高質(zhì)量封板膜避免蒸發(fā)造成熒光漂移。

• 軟件定期更新，保持?jǐn)?shù)據(jù)分析模塊最新。

• 避免反應(yīng)體系混合過(guò)程中產(chǎn)生氣泡，影響讀數(shù)。

• 實(shí)驗(yàn)后及時(shí)導(dǎo)出數(shù)據(jù)并進(jìn)行備份存檔。

九、未來(lái)發(fā)展方向

盡管ABI 7500已被廣泛應(yīng)用并形成穩(wěn)定用戶群，但隨著技術(shù)演進(jìn)，實(shí)時(shí)熒光定量PCR未來(lái)仍有以下發(fā)展趨勢(shì)：

• 多重?cái)U(kuò)增能力提升：更高通道數(shù)、更高光學(xué)分辨率。

• 通量升級(jí)與自動(dòng)化聯(lián)動(dòng)：與自動(dòng)加樣、提取系統(tǒng)對(duì)接，實(shí)現(xiàn)全流程一體化。

• 便攜化應(yīng)用拓展：適應(yīng)現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)需求，如突發(fā)疫情應(yīng)急檢測(cè)。

• AI輔助數(shù)據(jù)分析：引入機(jī)器學(xué)習(xí)算法優(yōu)化曲線識(shí)別與異常判斷。

• 與數(shù)字PCR融合：進(jìn)一步提升超低豐度靶標(biāo)的定量能力。

ABI 7500作為經(jīng)典平臺(tái)仍具備拓展?jié)摿Γ貏e是在臨床分子診斷領(lǐng)域，其穩(wěn)定性與可驗(yàn)證性是許多實(shí)驗(yàn)室選擇其為主力設(shè)備的關(guān)鍵因素。

十、結(jié)語(yǔ)

賽默飛ABI 7500實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀憑借其堅(jiān)實(shí)的技術(shù)基礎(chǔ)、高靈敏度、高通量能力與成熟的軟件平臺(tái)，已經(jīng)成為分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室、醫(yī)院檢驗(yàn)科和生命科學(xué)企業(yè)不可或缺的重要工具。它不僅為科研人員提供高質(zhì)量的核酸檢測(cè)結(jié)果，也為臨床分子診斷奠定了堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。

無(wú)論是進(jìn)行基因表達(dá)研究、病毒核酸檢測(cè)，還是執(zhí)行藥物篩選和遺傳突變分析，ABI 7500都能提供準(zhǔn)確、可靠、高效的數(shù)據(jù)支持。未來(lái)，隨著技術(shù)迭代升級(jí)，其應(yīng)用邊界將不斷拓展，為分子生物科學(xué)的發(fā)展持續(xù)注入動(dòng)力。