ViiA 7 實時熒光定量 PCR 儀是 Thermo Fisher Scientific 推出的一款高性能平臺,專為高通量、精密和自動化操作而設計。該儀器支持多種反應板格式(包括 96 孔、384 孔以及 TaqMan 微流控陣列卡),同時配備六通道檢測系統,可進行多重熒光檢測分析。其靈活性與兼容性使其在基礎科研、轉化醫學、遺傳病研究、臨床試劑開發等領域應用廣泛。
在介紹操作流程前,了解其核心性能對熟練使用至關重要:
多格式支持:兼容 96 孔(0.1 mL 和 0.2 mL)、384 孔反應板及 TaqMan Array 卡;
六通道熒光檢測系統:可同時檢測六種不同熒光染料;
VeriFlex 熱區技術:支持多溫區控溫,適合梯度優化實驗;
高分辨率 CCD 檢測系統:確保靈敏度和重現性;
自動開蓋裝置:提升上樣便捷性,適配自動化平臺;
完整軟件控制平臺:包括 ViiA 7 Software 和云端 Connect 平臺。
溫度保持在 18~25°C;
儀器置于無塵、防震的工作臺;
禁止陽光直射,遠離高頻磁場或噪音源。
檢查電源是否穩定接通;
儀器主機電源開關位于背部右下角;
打開操作系統,確認軟件正常加載,無錯誤提示。
對應孔板(0.1 mL、0.2 mL 或 384 孔);
密封膜或光學封板;
離心機或板式離心器;
移液器與無酶濾芯吸頭;
熒光探針或 SYBR Green 反應混合液;
DNA/cDNA 模板及引物。
啟動 ViiA 7 Software,登錄用戶賬戶。主界面包含以下模塊:
Experiment Setup(實驗設置);
Plate Setup(孔板布局);
Run Method(運行方案);
Analysis(數據分析);
Report(報告生成)。
點擊“New Experiment”,選擇實驗類型,如:
絕對定量(Standard Curve);
相對定量(ΔΔCt);
SNP 分型;
熔解曲線分析(Melt Curve);
拷貝數變異分析。
根據實驗目的設定 PCR 反應體系,包括反應體積(一般為 10–25 μL)、熒光染料類型(SYBR Green 或 TaqMan)、是否使用參考染料(如 ROX)等。
典型三步 PCR 熱循環設置如下:
初始變性:95°C,10分鐘;
變性:95°C,15秒;
退火/延伸:60°C,1分鐘(重復 40 周期);
熔解曲線分析(如需):60–95°C,增量為0.3°C。
可自定義熱區(VeriFlex 模塊)以優化引物退火溫度。
在 Plate Setup 中配置:
每個孔的實驗名稱(Sample Name);
靶基因名稱(Target);
引物/探針染料;
生物/技術重復設置;
陰陽性對照標注。
可以使用導入模板批量添加樣品布局。
按實驗設計添加模板 DNA、引物、探針或染料;
使用濾芯吸頭避免交叉污染;
加樣完畢后將反應板輕輕離心,去除氣泡。
使用光學封板確保密閉性;
若使用 Array 卡,將卡插入卡槽并校準;
檢查無液體殘留在板緣,以免污染加熱模塊。
打開上蓋;
將孔板正確定向插入槽中;
系統會自動識別孔板類型。
點擊“Start Run”;
軟件將實時顯示熒光擴增曲線;
實驗時長根據循環次數及模塊配置而定(通常40周期約需1小時30分鐘)。
實驗完成后,系統自動切換至 Analysis 頁面,展示擴增曲線、閾值線和結果表。
軟件可自動設定基線與閾值;
也可手動拖動閾值線,調整 Ct 計算;
確保閾值設定在線性對數放大階段。
導入標準曲線樣品;
軟件自動生成 Ct vs log(copy number) 標準曲線;
結果以 copies/μL 或 log10 表示。
設定參考基因(如 GAPDH);
選擇校準樣本作為相對值基礎;
系統生成折疊變化(fold change)結果及誤差柱狀圖。
設定 VIC 和 FAM 熒光通道;
分析模塊將自動繪制等位基因聚類圖;
結果分為純合、雜合和未定型。
曲線應具備單一峰值;
多峰表示非特異性擴增或引物二聚體;
可輔助判斷反應體系優化程度。
可將實驗數據導出為 Excel、PDF 或 TXT 格式;
報告中可包含樣品列表、Ct 值、熔解曲線圖等;
報告可自定義頁眉、頁腳、實驗編號、簽名位置等。
每周清潔樣品臺;
定期檢查熱循環模塊平整度;
使用原廠光學配件和板材;
若長時間停機,關閉電源,拔掉電纜。
使用 Connect 平臺可自動接收更新通知;
建議實驗結束后立即備份數據至本地或云端。
問題類型 | 可能原因 | 解決方案 |
---|---|---|
無法啟動 | 電源松動 | 檢查背部電源接頭 |
曲線異常 | 泡沫、污染、過量熒光 | 重做加樣、離心、檢查濃度 |
Ct值漂移 | 光學老化、探針失效 | 重新制備探針混合液 |
不識別板型 | 插入錯誤方向 | 檢查是否正插 |
基因表達分析:檢測基因上調或下調趨勢;
腫瘤突變識別:快速鎖定特定 SNP;
病原體檢測:高敏度核酸定量篩查;
藥物篩選:評估基因反應活性;
拷貝數變異:用于遺傳學研究與個體化醫學;
臨床基因診斷開發:配合TaqMan探針庫使用。
ViiA 7 實時熒光定量 PCR 儀器集成了六通道檢測系統、靈活板型支持、精密熱控和智能軟件分析平臺,為用戶提供從樣品制備到結果報告的一體化實時 PCR 解決方案。其高通量、高精度及自動化兼容特性使其適應當今科研與診斷環境的多樣化需求。
在熟悉操作流程基礎上,用戶可以靈活擴展實驗設計,實現如拷貝數變異分析、熔解曲線分型、單核苷酸多態性分型等高級應用,為精準醫療與分子研究提供強大支撐。
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