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質(zhì)保3年只換不修，廠家：長沙實(shí)了個驗(yàn)儀器制造有限公司。
羅氏實(shí)時熒光定量PCR儀是一種用于核酸擴(kuò)增及實(shí)時熒光檢測的高精密儀器。它結(jié)合了傳統(tǒng)PCR技術(shù)與熒光探針檢測技術(shù)，通過實(shí)時監(jiān)測PCR反應(yīng)過程中熒光信號的變化，實(shí)現(xiàn)核酸的定量分析。本儀器具有靈敏度高、重復(fù)性好、反應(yīng)速度快等特點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于臨床分子診斷、病原檢測、基因表達(dá)研究、藥物篩選及食品安全檢測等領(lǐng)域。
本實(shí)驗(yàn)步驟旨在指導(dǎo)使用者正確操作羅氏實(shí)時熒光定量PCR儀，從樣品準(zhǔn)備、反應(yīng)體系配置到數(shù)據(jù)分析與結(jié)果判讀，確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性與可重復(fù)性。
室溫應(yīng)保持在18℃～30℃之間，相對濕度30%～80%。
環(huán)境應(yīng)清潔、無塵、無強(qiáng)光照射。
避免電磁干擾及震動，儀器需放置在平穩(wěn)工作臺上。
實(shí)驗(yàn)室應(yīng)設(shè)有獨(dú)立的核酸提取區(qū)、擴(kuò)增反應(yīng)配置區(qū)與產(chǎn)物分析區(qū)，以防交叉污染。
羅氏實(shí)時熒光定量PCR儀主機(jī)一臺。
專用光學(xué)反應(yīng)管或96孔反應(yīng)板。
熒光定量PCR專用試劑盒。
微量移液器及無RNA酶吸頭。
冷卻架、離心機(jī)、漩渦混合器等輔助設(shè)備。
配套計算機(jī)及數(shù)據(jù)分析軟件。
PCR反應(yīng)混合液（Master Mix）。
正向、反向引物及熒光探針。
模板核酸（DNA或RNA，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄生成cDNA）。
無核酸酶水（ddH?O）作為陰性對照。
陽性標(biāo)準(zhǔn)品用于系統(tǒng)驗(yàn)證。
按樣品類型提取核酸。常見方法包括離心柱法、磁珠法或自動提取系統(tǒng)。
用分光光度計檢測核酸濃度與純度，確保A260/A280值在1.8～2.0之間。
根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計，將提取的核酸稀釋至適當(dāng)濃度備用。
所有樣品在操作過程中應(yīng)防止RNA/DNA降解，避免反復(fù)凍融。
每個PCR反應(yīng)體系常為20 μL或25 μL，典型配方如下（僅供參考）：
| 組分 | 體積（μL） | 備注 |
|---|---|---|
| Master Mix | 10.0 | 含緩沖液、dNTPs、Taq酶 |
| 上游引物（10 μM） | 0.5 | 特異性設(shè)計 |
| 下游引物（10 μM） | 0.5 | 特異性設(shè)計 |
| 探針（10 μM） | 0.5 | 熒光標(biāo)記探針 |
| 模板核酸 | 2.0 | 根據(jù)實(shí)驗(yàn)濃度調(diào)整 |
| 無核酸酶水 | 6.5 | 調(diào)整總體積 |
配置時需在低溫條件下完成，混合均勻后輕輕離心，確保液體集中于管底。
將反應(yīng)體系分別加入PCR管或96孔反應(yīng)板中。
用光學(xué)封板膜密封，防止蒸發(fā)或交叉污染。
使用離心機(jī)短暫離心，使液體沉至孔底并排出氣泡。
樣品順序及位置應(yīng)與軟件輸入相一致，以便后期數(shù)據(jù)對應(yīng)。
打開羅氏實(shí)時熒光定量PCR儀，預(yù)熱系統(tǒng)。
在軟件中創(chuàng)建新實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目，輸入樣品信息、孔位布局及反應(yīng)類型。
設(shè)定溫控程序：
變性：95℃，10秒
退火/延伸：60℃，30秒（采集熒光信號）
初始變性：95℃，3分鐘
擴(kuò)增循環(huán)（40次）：
選擇合適的熒光檢測通道（如FAM、HEX、ROX等），根據(jù)探針類型匹配濾光片。
保存設(shè)定并啟動實(shí)驗(yàn)。
儀器運(yùn)行期間，系統(tǒng)自動采集熒光信號。可通過軟件實(shí)時觀察擴(kuò)增曲線的上升情況。若出現(xiàn)異常波動，可暫停檢查樣品或反應(yīng)體系是否存在問題。
整個擴(kuò)增過程約需1～1.5小時，具體時間取決于反應(yīng)體系與升降溫速率。
擴(kuò)增曲線分析
軟件自動繪制每個樣品的熒光擴(kuò)增曲線。有效擴(kuò)增曲線應(yīng)呈S形，基線階段平穩(wěn)，指數(shù)階段上升明顯，平臺期穩(wěn)定。
閾值與Ct值設(shè)定
由系統(tǒng)根據(jù)基線信號自動計算閾值，或手動設(shè)置。Ct（Cycle threshold）值為熒光信號超過閾值時的循環(huán)數(shù)，是定量分析的關(guān)鍵參數(shù)。
標(biāo)準(zhǔn)曲線建立
若為絕對定量實(shí)驗(yàn)，應(yīng)輸入系列稀釋標(biāo)準(zhǔn)品濃度，軟件將自動生成標(biāo)準(zhǔn)曲線（Ct值對數(shù)線性關(guān)系），并計算樣品中目標(biāo)基因的拷貝數(shù)。
相對定量分析
對于基因表達(dá)研究，通常以內(nèi)參基因（如β-actin、GAPDH）為對照，計算ΔCt、ΔΔCt及表達(dá)倍數(shù)變化。
熔解曲線分析
若使用SYBR Green染料體系，應(yīng)進(jìn)行熔解曲線分析，以判斷擴(kuò)增產(chǎn)物特異性。單一峰值代表特異性擴(kuò)增，多個峰值提示引物二聚體或非特異性擴(kuò)增。
陽性樣品：Ct值在設(shè)定閾值范圍內(nèi)且擴(kuò)增曲線正常。
陰性樣品：未檢測到有效熒光信號，Ct值>40或無擴(kuò)增曲線。
可疑結(jié)果：Ct值接近閾值邊界（如37～40），應(yīng)重復(fù)檢測確認(rèn)。
對照結(jié)果：陽性對照應(yīng)有典型曲線，陰性對照無信號，否則實(shí)驗(yàn)無效。
最終結(jié)果可導(dǎo)出Excel或PDF格式，并生成檢測報告。報告中應(yīng)包含樣品編號、Ct值、標(biāo)準(zhǔn)曲線、熔解曲線及定量結(jié)果。
| 問題現(xiàn)象 | 可能原因 | 處理方法 |
|---|---|---|
| Ct值偏高 | 模板濃度低或酶活下降 | 檢測模板純度或更換試劑 |
| 無擴(kuò)增曲線 | 通道設(shè)置錯誤 | 檢查探針與通道匹配 |
| 擴(kuò)增曲線不平滑 | 氣泡或反應(yīng)不均勻 | 離心樣品后重新上機(jī) |
| 熔解曲線多峰 | 引物二聚體 | 優(yōu)化引物設(shè)計或退火溫度 |
| 曲線漂移 | 燈源老化或光路污染 | 清潔光學(xué)系統(tǒng)或聯(lián)系廠家維護(hù) |
實(shí)驗(yàn)中需全程佩戴防護(hù)手套，避免污染。
不同樣品及試劑操作應(yīng)使用獨(dú)立吸頭。
所有反應(yīng)體系應(yīng)在冰上配制，防止酶提前反應(yīng)。
使用后及時清潔樣品臺面及儀器外殼。
定期更新儀器軟件版本以保持功能兼容性。
若儀器長期未使用，應(yīng)定期通電自檢，保持系統(tǒng)穩(wěn)定。
實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，用干凈軟布擦拭儀器表面及樣品倉。
禁止使用酒精或腐蝕性液體清潔光學(xué)組件。
定期校準(zhǔn)溫度及光學(xué)系統(tǒng)，每6個月建議由廠家技術(shù)工程師進(jìn)行全面檢修。
若儀器出現(xiàn)異常噪音或溫控失衡，應(yīng)立即停止使用并聯(lián)系售后服務(wù)。
羅氏實(shí)時熒光定量PCR儀由長沙實(shí)了個驗(yàn)儀器制造有限公司制造，享有質(zhì)保3年，只換不修的服務(wù)政策。在質(zhì)保期內(nèi)，如出現(xiàn)非人為故障，廠家將免費(fèi)更換整機(jī)或主要部件。售后服務(wù)包括安裝調(diào)試、用戶培訓(xùn)、軟件升級、遠(yuǎn)程技術(shù)支持及上門維護(hù)，確保用戶長期穩(wěn)定使用。
羅氏實(shí)時熒光定量PCR儀以精準(zhǔn)的溫控系統(tǒng)、靈敏的光學(xué)檢測、智能化的軟件分析和優(yōu)越的穩(wěn)定性能，為科研和臨床檢測提供了可靠的技術(shù)平臺。嚴(yán)格遵循實(shí)驗(yàn)步驟與維護(hù)規(guī)范，不僅能保證數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性與重復(fù)性，還能延長儀器使用壽命。配合廠家提供的三年更換保障政策，用戶可在核酸檢測與分子生物學(xué)研究中獲得更高效率與更強(qiáng)信心。
杭州實(shí)了個驗(yàn)生物科技有限公司
